【摘要】目的：探討中藥單體欖香烯(effectsofe lemene,Ele)對人晶狀體上皮細胞系(humanlen sepithelialcellsB3,HLE B3)內Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白合成的影響。方法：利用10μg/L堿性成纖維細胞生長因子(recombinanthuman basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導HLE B3增殖，將80mg/L的Ele作用在處于增殖狀態下的HLE B3，24h后采用雙抗體夾心ABC 酶聯免疫吸附測定法(enzyme linkedimmuno sorbentassay,ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達。結果：rhbFGF作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白濃度為53.5±5.4μg/L，較正常組(38.5±2.3μg/L)明顯升高，Ele作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白的濃度為29.5±2.9μg/L，較rhbFGF組明顯下降(P<0.01)。rhbFGF作用后HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白濃度為1.27±0.29μg/L，較正常組(0.83±0.12μg/L)明顯升高，Ele作用后HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白的濃度為0.69±0.11μg/L，較rhbFGF組明顯下降(P<0.01)。結論：Ele抑制rhbFGF誘導的HLE B3增殖的同時也能抑制HLE B3內Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白合成，干擾HLE B3纖維化，可望成為防治后囊膜混濁的理想藥物。

【關鍵詞】欖香烯晶狀體;上皮細胞后囊膜混濁;Ⅰ型膠原蛋白;Ⅲ型膠原蛋白

引言

膠原蛋白(collagen)或稱膠原，是動物細胞合成的一種生物性高分子，是一類最主要的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)。目前的研究表明，ECM與后囊膜混濁的關系密切：ECM是構成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ，Ⅲ和IV型膠原;此外ECM還可調節細胞生長分化及細胞運動。欖香烯(elemene，Ele)是天然藥物莪術的主要成分，具有抗血栓形成、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡^①②，我們的研究發現Ele能抑制由重組人堿性成纖維細胞生長因子(recombinant human basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導的人晶狀體上皮細胞系(humanlensepithelialcellsB3,HLE B3)增殖(另文報道)，我們進一步采用雙抗體夾心ABC酶聯免疫吸附測定法(enzyme linke dimmunosorbentassay，ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白(collagenI)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenIII)表達，探討Ele是否在抑制HLE B3增殖的同時還能抑制HLE B3內Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的合成，從而對阻止晶狀體上皮細胞纖維化起重要的作用。

1、材料和方法

1.1 材料

人晶狀體上皮細胞系HLE B3由廣州中山大學眼科研究中心提供;Ele乳液，純度99.0%，大連金港制藥有限公司;rhbFGF為英國PeproTech公司;DMEM培養基、胰蛋白酶和EDTA分別是美國Gibco公司、美國Amresco公司和美國Augus公司;Ⅰ型膠原蛋白(collagenI)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenIII)的ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。自動酶標讀數儀：美國BioTekELX808;倒置研究顯微鏡：日本IMT 413;二氧化碳培養箱：美國FORMA2111。取出保存凍存細胞的凍存管立即放入37℃水中，將溶解的細胞懸液用10倍體積以上的培養液進行稀釋，離心，除上清，反復洗滌3次。以5×108個/L接種于培養瓶中，37℃，50mL/LCO2培養箱培養。待細胞生長融合后進行傳代培養。

1.2 方法

80mg/LEle作用24h后收集細胞上清液;取出已經包被了抗人Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體的96微孔板。設標準孔8孔，每孔各加入標準稀釋液100mL，第1孔加標準品100μL，均勻后用加樣器吸出100μL，移至第2孔。如此反復作對倍稀釋至第7孔，最后從第7孔中吸出100μL棄去，使之體積均為100μL，第8孔為空白組。待測品孔每孔各加入細胞上清液100μL，每組6個孔;將反應板充分混勻后置37℃，120min;用洗滌液將反應板充分洗滌5次，在濾紙上印干;每孔加第一抗體工作液50μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加酶標抗體工作液100μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加底物工作液100μL，置37℃暗處反應10min;每孔加50μL終止液混勻。在492nm處測吸光度值;根據標準品A值畫出標準曲線，根據樣品A值在該曲線圖上查出相應的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量。

統計學分析：數據以均數±標準差(±s)表示，采用SPSS12.0統計軟件進行數據處理。

2、結果

rhbFGF組HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白含量較空白組明顯增加，與空白組之間差異具有統計學意義(P<0.01;Ele組HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白含量較rhbFGF組明顯下降，與rhbFGF組之間差異具有統計學意義(P<0.01)。說明Ele能降低HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白含量。rhbFGF組HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白含量較空白組明顯增加，與空白組之間差異具有統計學意義(P<0.01);Ele組HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白含量分別較rhbFGF組明顯下降，與rhbFGF組之間差異具有統計學意義(P<0.01)。說明Ele能降低HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白含量。Ele對HLE B3內Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白含量的影響

3、討論

膠原蛋白或稱膠原，是動物細胞合成的一種生物性高分子，是ECM中最主要的一類物質。經過數十年來的研究和發展,業已發現并確認了膠原蛋白有25種類型，其中Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白約占膠原蛋白總量的80%～90%。膠原蛋白纖維化是許多疾病的病理表現之一，膠原蛋白分子的異常合成和沉積是纖維化反應的基礎。如彌漫性肺纖維化早期表現為肺泡炎，后期為彌漫性肺間質纖維化,主要是肺間質中成纖維細胞數及其產生的膠原蛋白和其他結締組織成分增多，肺泡壁遭破壞，特發性肺間質纖維化時，肺組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原增高，肺臟變硬，順應性減退^③。有研究表明，高血壓左心室肥厚時不僅存在心肌肥大的變化，心肌間質纖維化亦是重要的病理改變，Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白的表達增強,促進了間質的纖維化^④。ECM是構成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原，ECM可調節細胞生長分化及細胞運動。纖維粘連蛋白等ECM可促進某些黏附分子磷酸化，從而促進細胞移行。白內障摘除術后，殘留的晶狀體上皮細胞通過細胞膜上的黏附分子與細胞外基質及細胞內骨架蛋白相連，促使細胞移行并發生晶狀體后囊膜皺縮。Ishida等^⑤研究發現：米諾地爾能抑制體外培養的晶狀體上皮細胞的增殖、移行及膠原分泌。張鳳妍等^⑥探討表皮生長因子、白細胞介素1、干擾素和生長抑素8肽在晶狀體后囊膜混濁形成中的作用及影響膠原合成的機制，發現表皮生長因子、白細胞介素1參與晶狀體后囊膜混濁形成時的膠原合成，干擾素和生長抑素8肽的作用提示其可用于防治晶狀體后囊膜混濁。在本研究中，10μg/LrhbFGF作用后，HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白濃度為53.5±5.4μg/L，較正常組(38.5±2.3μg/L)明顯升高，說明rhbFGF能促進HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白的合成。經Ele作用后，HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白的濃度為29.5±2.9μg/L，較rhbFGF組明顯下降。結果提示，Ele能抑制HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白的合成。我們還發現，10μg/LrhbFGF作用后，HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白濃度為1.27±0.29μg/L，較正常組(0.83±0.12μg/L)明顯升高，說明rhbFGF能促進HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白的合成。經Ele作用后，HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白的濃度為0.69±0.11μg/L，較rhbFGF組明顯下降。本結果提示，Ele能抑制HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白的合成。本結果提示，rhbFGF在促進HLE B3增殖的同時，也能促進HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的合成;Ele能有效抑制HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的合成。進一步說明作為ECM重要成分的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，是構成纖維化性混濁的重要原因，也是導致晶狀體后囊膜纖維化并發生混濁的重要機制。Ele有望成為防治后發性白內障的有效藥物。

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